背景概述

B-NDG^®小鼠（NOD.CB17-Prkdc^scidIl2rg^tm1Bcgen/Bcgen）是百奥赛图公司自主开发的，NOD-scid遗传背景的Il2rg基因敲除小鼠，缺乏成熟的T、B和NK细胞，是目前国际公认的免疫缺陷程度高、非常适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。

• NOD（non-obese diabetes）遗传背景：自发I型糖尿病；其巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱；先天免疫系统，如补体系统和树突状细胞功能降低。

• Prkdc null（DNAPK,scid）：Prkdc（protein kinase DNA-activated catalytic）基因突变，小鼠的功能性T和B细胞缺失，淋巴细胞减少，表现为细胞免疫和体液免疫的重度联合免疫缺陷（severe combined immunedeficiency, scid）。

• Il2rg null：Interleukin-2受体的gamma链（IL-2R γc，又称CD132）位于小鼠X染色体上，是具有重要免疫功能的细胞因子IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的共同受体亚基，该基因敲除后的小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。

B-NDG^®小鼠：综合了NOD-scid-Il2rg null背景特征，具有重度免疫缺陷表型，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞，细胞因子信号传递能力缺失等。非常适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。

B-NDG 小鼠优势

• 世界公认的重度免疫缺陷小鼠

• 与NOD-scid小鼠相比寿命更长，平均长达1.5年

• 对人源细胞和组织几乎没有排斥反应

• 少量细胞即可成瘤，依赖于细胞系或细胞类型

• 无B淋巴细胞泄漏

主要应用领域

• 人源细胞或组织移植

• 肿瘤和肿瘤干细胞研究

• ES和iPS细胞研究

• 造血和免疫学研究

• 人类疾病感染模型研究

• 新的人源化动物模型研发

B-NDG商标申请

百奥赛图(北京）生物医药科技股份有限公司分别对“B-NDG”进行了第5类、第31类、第42类和第44类进行了商标申请。各字母代表含义：B-Biocytogen; N-NOD background; D- DNAPK(Prkdc) null; G- G: IL2rg knockout。

第5类：人用药；医用水蛭；医用生物标志物诊断试剂；医用或兽医用微生物培养物；医用营养食物；净化剂；兽医用制剂；杀虫剂；医用填料；兽医用干细胞（截止）

第31类：活动物；活家禽；活鱼；甲壳动物（活的）；树木；谷（谷类）；植物；植物种子；动物栖息用干草；饲料（截止）

第42类：质量控制；化学研究；生物学研究；临床试验；材料测试（截止）

第44类：医药咨询；医院；人工授精；饮食营养指导；动物养殖；兽医辅助；人工授精（替动物）；试管授精（替动物）；卫生设备出租；试管授精（截止）

小鼠饲养注意事项

1. 饲养环境

2. 饲料

3. 饮水

4. 垫料

5. 环境

• 在饲养过程中，保证足够的光照强度（太强或太弱都不行）和光照时间，一般采用12小时光照，12小时黑暗的光照模式。
• 环境温度应保持在20-26℃，日温差不超过4℃。
• 环境湿度应保持40-70%。
• 饲养笼盒材质要无毒无害，便于清洁和消毒。

6. 运输

• 百奥赛图目前采用陆运和空运两种方式运输，运输箱为高压过的塑料运输箱，可以保证运输过程中小鼠的微生物级别。运输箱内会准备好饲料、垫料、凝胶果冻等，保证小鼠的正常饮食和活动。
• 运输过程中我们会尽量保证轻拿轻放，避免小鼠在途中颠簸，但小鼠在运输过程中依然可能会有应激反应，加速小鼠的代谢和排泄。尽管我们在运输箱内添加了果冻供动物采食，小鼠还是有可能出现不同程度的脱水状况导致体重减轻。一般运输所造成的小鼠体重消耗为10%左右，如果运输时间长、路途远、装箱密度大，体重消耗可能达到15%。不过这种情况一般经过7-15天的适应性饲养（建议使用科奥协力生长繁殖饲料），大部分小鼠可恢复体重（不能保证100%同步恢复）。

7. 适应性饲养

表型分析

小鼠生长曲线

图1. B-NDG小鼠生长曲线

雌雄小鼠各50只，小鼠3周龄断奶后（出生日期±3天）每周固定日期进行称重，数据收集共13周。

小鼠血清抗体检测

图2. B-NDG^®小鼠血清抗体亚类检测

(A)空白对照及B-NDG小鼠OD值均在0.04左右，BALB/c小鼠OD值显著高于B-NDG 小鼠，可认为B-NDG 小鼠血清中无IgG和IgM存在。(B)空白对照孔OD450均在0.06左右，本底值低于0.1，说明捕获抗体、酶标抗体和BSA之间没有交叉反应。分别检测BALB/c小鼠和B-NDG 小鼠血清IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，BALB/c小鼠体内存在IgG各亚类抗体，B-NDG小鼠血清中不存在IgG各亚类抗体（n=3）。

结果表明：B-NDG小鼠作为缺失T细胞、B细胞的重度免疫缺陷模式小鼠，体内不存在任何类型的Ig抗体。

T细胞、B细胞和NK细胞的检测

图3. B-NDG小鼠的T 、B和NK细胞的完全缺失

从 C57BL/6N、NOD-scid 和B-NDG小鼠（n=3，6 周龄，雌性）中分离血细胞，脾细胞，骨髓。对其进行流式细胞术分析，以评估白细胞亚群。 (A) 代表性流式图。 (B) FACS 分析结果，在 C57BL/6N 小鼠中可检测到 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞，在NOD-scid小鼠中可检测到NK细胞，但在 B-NDG 小鼠中均未检测到。

髓系细胞免疫分型

图4. B-NDG小鼠的髓系细胞分型

从 C57BL/6N、NOD-scid 和B-NDG小鼠（n=3，6 周龄，雌性）中分离血细胞，脾细胞，骨髓。对其进行流式细胞术分析，以评估髓系细胞亚群。结果显示，在B-NDG小鼠中可检测到髓系细胞。

Granulocytes :mCD45+mGr-1+， DCs:mCD45+mCD11c+, Macrophages:mCD45+mCD11b+mF4/80+,

Monocytes: mCD45+mCD11b+mF4/80-.

B-NDG脾脏组织学检测

图5.小鼠脾脏组织切片及HE染色

取C57BL/6、NOD-scid 和 B-NDG小鼠（n = 3，9 周龄，雌性）脾脏，对脾脏样本进行组织切片及HE染色。结果显示：C57BL/6 小鼠脾脏结构正常，滤泡清晰。NOD-scid 小鼠的脾脏显示白髓发育不全。B-NDG 小鼠的脾脏显示滤泡结构完全丧失。

B-NDG脾脏组织学检测

图6.小鼠脾脏组织切片及IHC染色

取C57BL/6、NOD-scid 和 B-NDG小鼠（n = 3，9 周龄，雌性）脾脏，对脾脏样本进行组织切片及IHC染色。结果显示：C57BL/6 小鼠脾脏 CD3ε 和 CD19 表达正常（棕色），小鼠 B-NDG 小鼠无 CD3ε 和 CD19 表达。

血常规检测

图 7. B-NDG 小鼠的全血细胞计数 (CBC)

试验采集 B-NDG 小鼠（n = 6，6 周龄，雌）的血液并分析 CBC。数值表示为平均值±SEM。

血生化检测

图 8. B-NDG 小鼠血液生化检测结果 。

采集 B-NDG 小鼠(n = 6，6 周龄，雌)的血清，并分析 ALT、AST、CHOL、CR、GLU、TRIG 和 UREA 的水平。数值表示为平均值±SEM。仪器：Thermo Fisher scientific#Indiko

CDX 肿瘤模型及药效评价

CDX 淋巴癌转移模型

图9. Raji淋巴肿瘤细胞在B-NDG^®小鼠上能更有效地建立系统和转移肿瘤模型。

对B-NDG^®、NOD-scid、BALB/c Nude小鼠通过尾静脉注射相同数量（5 × 10⁵）的Raji细胞，后在不同的时间点记录并分析小鼠的如下各种指标。

A.细胞接种后记录小鼠生存情况，绘制Kaplan-Merier生存曲线。

B.细胞接种后每周小鼠体重变化(g)，并计算出相对于接种当天的相对体重。

C.小鼠外周血中人源细胞百分率变化。接种Raji细胞后，每周通过眼眶静脉丛采取100 μl全血，提取DNA，通过q-PCR技术检测小鼠外周血中人源细胞比率。

D.接种Raji细胞后小鼠肝脏对比。接种后待小鼠体重下降超过30%后执行安乐死并解剖脏器，进行拍照。

E.接种Raji细胞后小鼠脏器免疫组化染色。一抗为鼠抗人线粒体膜蛋白抗体。

B-NDG^®小鼠 CDX淋巴癌体内药效实验

图10. 基于B-NDG小鼠的Raji淋巴癌转移模型及药效评价

对B-NDG^®小鼠通过尾静脉注射相同数量（5×10⁵）的Raji-Fluc细胞，并在第3天以及第10天尾静脉注射相同计量的抗体X，之后在不同的时间点成像观察肿瘤生长状况。A.不同时间点对小鼠成像观察肿瘤生长情况；B.不同分组小鼠成像下肿瘤细胞荧光强度曲线。结果表明，早期治疗（Raji细胞移植3天，10天）的治疗效果显著，晚期治疗（Raji细胞移植10天）的治疗效果明显变差，基本无效。

B-NDG^®小鼠进行抗人CD47抗体药效验证实验

图11.利用B-NDG^®小鼠进行抗人CD47抗体药效验证实验

使用B-NDG小鼠建立Raji淋巴瘤模型并验证抗人CD47抗体的药效。在B-NDG小鼠中通过尾静脉注射B-luc-GFP Raji细胞（5×10⁵），利用小动物活体光学成像系统（IVIS）观察肿瘤的生长状况。待肿瘤的荧光强度达到1E6左右时将动物入组至对照组和治疗组（n=6）。(A) 小鼠肿瘤的荧光强度曲线；(B) 小鼠的体重变化。 结果显示：3种抗人CD47抗体都能显著性抑制肿瘤的生长。说明B-NDG小鼠可以用来建立肿瘤模型并验证抗体的体内药效。数值表示为平均值±SEM。

B-NDG^®小鼠进行CAR-T药效验证实验

图 12.CAR-T 疗法在 B-NDG 小鼠中的抗肿瘤活性。

使用B-NDG小鼠建立Raji淋巴瘤模型并验证CAR-T的药效。在B-NDG小鼠中通过尾静脉注射B-luc-GFP Raji细胞（5×10⁵），利用小动物活体光学成像系统（IVIS）观察肿瘤的生长状况。待肿瘤的荧光强度达到1E6左右时将动物入组至对照组和治疗组（n=6），注射的CAR-T细胞数为1E7。(A)小鼠肿瘤的荧光强度曲线；(B)小鼠的体重变化。结果显示：4 种CAR-T细胞在B-NDG 小鼠构建的肿瘤模型中表现出不同的肿瘤抑制活性。说明B-NDG小鼠可以用来建立肿瘤模型并验证CAR-T的药效。数值表示为平均值±SEM。

使用B-NDG小鼠建立CDX模型并验证ADC药物的药效

比较3种不同Her2表达量的细胞系在B-NDG小鼠中建立CDX模型后验证靶向Her2的ADC药效的差异。分别将A431、BT-474、NCI-H1975细胞接种到B-NDG小鼠的皮下，待肿瘤体积长到合适大小开始分组并静脉给药，使用的药物来源为内部合成（in house）或直接购买商品化的药物（药物名称后没有标记“in house”）。(A) CDX模型构建及给药策略示意图；(B) 体外培养的A431、BT-474、NCI-H1975细胞中人Her2的表达水平检测；(C) 3种细胞系分别构建CDX模型并验证靶向Her2的ADC药物的药效。结果显示：BT-474和NCI-H1975细胞中高表达Her2，而A431细胞中的Her2表达量非常低。靶向Her2的ADC药物能显著性地抑制高表达Her2的细胞系（BT-474、NCI-H1975）构建的CDX模型中肿瘤的生长，但对低表达Her2的肿瘤（A431）抑制作用比较弱。说明通过选择靶点表达量高的细胞系在B-NDG小鼠中构建CDX模型可以成功用于验证ADC药物的体内药效。数值表示为平均值±SEM。

使用B-NDG小鼠建立胰腺原位CDX模型并验证ADC的药效

使用B-NDG小鼠建立胰腺原位MIA Paca-2胰腺癌模型并验证ADC药的药效。将B-luc MIA Paca-2细胞（1E5）移植到B-NDG小鼠的胰腺组织中（雌性，7周龄），利用小动物活体光学成像系统（IVIS）观察肿瘤的生长状况。待肿瘤的荧光强度达到7E7 p/sec 左右时将动物分组并分别腹腔注射两个剂量的ADC药物（n=6）。(A) 小鼠成像观察肿瘤的生长状况；(B) 小鼠肿瘤的荧光强度曲线；(C) 小鼠的体重变化。结果显示：ADC能显著性抑制在B-NDG小鼠构建的原位B-luc MIA Paca-2结肠癌模型中肿瘤的生长。说明B-NDG小鼠可以用来建立B-luc MIA Paca-2胰腺原位肿瘤模型并验证ADC的体内药效。数值表示为平均值±SEM。

在B-NDG小鼠中移植人PBMCs重建人T细胞

使用人PBMCs重建的B-NDG小鼠建立结肠原位CDX模型并验证抗体的药效

在B-NDG成体鼠中移植人造血干细胞（CD34+ HSCs）成功重建人的T、B细胞和少量NK细胞及髓系细胞。6周龄雌性B-NDG小鼠，经1.0 Gy的X射线辐照后，4-12小时内通过尾静脉注射人CD34+ HSCs（1.5E5）（n=5），取外周血使用流式细胞术检测人免疫细胞的重建水平。(A) 人CD34+ HSCs移植后小鼠的生存曲线； (B)小鼠的体重变化； (C) 各类人免疫细胞的重建比例。结果显示：人CD34+ HSCs移植22周前未发现有小鼠死亡，重建160天有一只小鼠死亡；小鼠体重持续升高。人CD45+细胞的比例在移植6周时已超过25%，移植24周时仍能维持在25%左右；人T细胞的比例在重建10周时开始持续升高；人B细胞的比例在重建6周时的比例达90%以上，8周后持续下降；NK细胞的比例在重建后维持在0.5%-2%之间；髓系细胞的比例在重建后的平均值维持在1%-6%之间；单核细胞占髓系细胞的比例在重建后升高，最高比例达到70%左右，后续一直维持在50%以上；中性粒细胞占髓系细胞的比例在重建后的平均值维持在3%-20%之间。移植不同donor来源的人CD34+ HSCs、不同的辐照仪及辐照剂量会导致重建水平稍有差异，但重建水平的变化趋势类似。注：B-NDG小鼠中人CD34+ HSCs重建成功的标准：重建12周时外周血中hCD45+细胞的比例≥25%。

在B-NDG小鼠中移植人CD34+ HSCs重建人免疫系统（新生鼠）

在B-NDG新生鼠中移植人造血干细胞（CD34+ HSCs）成功重建人的T、B细胞和少量NK细胞及髓系细胞。出生24-48小时的未区分性别的B-NDG新生鼠，经0.8 Gy的X射线辐照，4-12小时内通过面部的颞静脉注射人CD34+ HSCs（3E4）（n=28），取外周血使用流式细胞术检测人免疫细胞的重建水平。(A) 人CD34+ HSCs移植后小鼠的生存曲线；(B)小鼠的体重变化；(C) 各类人免疫细胞的重建比例；(D) 各类人免疫细胞的重建数量。结果显示：小鼠从重建17周开始出现死亡，体重持续增长。人CD45+细胞的比例从重建8周开始≥25%，但有明显的个体差异；人T细胞的比例在重建10周时开始持续升高，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Treg细胞都有一定比例的重建；人B细胞的比例在重建6周时已达到70%以上，8周达到最高值后持续缓慢下降；NK细胞的比例在重建12周后处于1%以下；髓系细胞的比例在重建后先降低，12周开始持续升高，维持在1%-10%之间；单核细胞占髓系细胞的比例在重建后升高，最高比例达到80%左右，后续一直维持在40%-80%之间；粒细胞占髓系细胞的比例在3%-13%之间。从重建的人免疫细胞数量上看，人CD45+细胞、B细胞、总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、总髓系细胞和单核细胞都有一定数量的重建，人NK细胞和粒细胞数量很少。移植不同donor来源的人CD34+ HSCs、不同的辐照仪及辐照剂量会导致重建水平有差异，但重建趋势类似。注：B-NDG小鼠中人CD34+ HSCs重建成功的标准：重建12周时外周血中hCD45+细胞的比例≥25%。