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表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是肿瘤治疗领域的经典靶点，广泛表达于多种实体瘤中[1]。但EGFR也在正常组织中具有生理表达，尤其常见于皮肤和胃肠道上皮[2]。这一特点使EGFR靶向药物在发挥抗肿瘤作用的同时，也可能带来靶点介导毒性。
对于EGFR ADC而言，安全性问题更为复杂。除抗体本身可能引起的靶内毒性外，ADC偶联的细胞毒性载荷会在靶细胞内释放，进一步放大对正常组织的损伤风险[3]。因此，在EGFR ADC早期开发阶段，通过非GLP毒理学研究获得机制驱动的安全性信息，有助于降低后续开发风险，并支持候选分子筛选。
临床上，已上市抗EGFR单克隆抗体如西妥昔单抗（cetuximab）和帕尼单抗（panitumumab），可因正常组织EGFR通路受到抑制而诱导剂量相关毒性。常见不良反应包括痤疮样皮疹、黏膜炎、腹泻和眼部不良事件。这些毒性已成为限制EGFR靶向药物治疗窗的重要因素[4,5,6]。
在ADC药物中，细胞毒性载荷的释放可能进一步加重局部组织损伤，并诱发更复杂的全身性反应。这使EGFR ADC的安全性评价不仅需要关注抗体与靶点的结合，也需要综合判断载荷、组织表达和暴露水平之间的关系。
图1 EGFR单克隆抗体的抗癌活性机制和在正常人体组织器官的蛋白质表达
（A）西妥昔单抗和帕尼单抗通过与EGFR结合，从而阻止经由PI3K/mTOR和RAS/ERK通路的进一步信号转导。生长信号通路的失活可抑制细胞增殖和存活。（B）EGFR在人体内表现为从低组织特异性到高组织特异性的连续分布。
传统非GLP毒理学评价通常依赖野生型小鼠或荷瘤小鼠。然而，鼠源Egfr与人源EGFR在氨基酸序列和抗原表位上存在差异，导致靶向人EGFR的候选药物难以充分识别鼠源靶点。
这一局限使传统模型难以真实模拟药物在人体内可能出现的靶内安全性信号。对于EGFR ADC这类复杂生物制剂而言，模型的靶点相关性直接影响毒理学数据的转化价值。因此，建立表达生理性人源EGFR的体内模型，是提升早期安全性评价质量的重要基础。
依托基因编辑技术平台，百奥赛图构建了B-hEGFR mice人源化小鼠模型。该模型通过精准原位基因替换策略，将小鼠Egfr基因编码胞外结构域的全基因组序列替换为对应的人源EGFR序列，同时保留跨膜区、胞内结构及内源性调控元件。
这一设计使人源EGFR蛋白能够在小鼠体内保持生理性表达，并维持EGFR介导的信号通路功能。模型验证结果显示，人EGFR蛋白可在B-hEGFR小鼠的脑、肝脏、肺、肾、食道、皮肤、子宫和卵巢等组织中表达。该模型可为EGFR靶向药物，尤其是EGFR ADC的靶内毒性评价提供更具临床相关性的体内环境。
图2 EGFR信号通路和B-EGFR小鼠的验证
（A）EGFR细胞内结构和下游通路。（B-D）B-EGFR人源化小鼠中EGFR的mRNA与蛋白表达分析，对比野生型小鼠，人EGFR蛋白分别在EGFR人源化小鼠的脑，肝脏，肺，肾，食道，皮肤，子宫和卵巢都有表达。
基于B-hEGFR小鼠开展非GLP毒理学研究，可更早识别候选分子可能引起的皮肤、胃肠道、眼部及其他靶器官毒性。该模式有助于申办方在进入正式GLP研究前，判断候选分子的安全性边界，并优化后续研究设计。
百奥赛图已建立完整的病理学与非GLP毒理药理服务平台，覆盖血液学检测、临床化学分析、全面组织病理学评价、特殊染色与成像，以及定量和高通量分析。这些能力能够帮助研究者从定性和定量两个层面捕获早期毒理学信号，支持包括ADC在内的复杂生物制剂开发。
图3 百奥赛图的非GLP毒理药理服务能力和平台
在第一个案例中，研究者选用两种已上市EGFR单抗作为参照药物，包括西妥昔单抗生物类似药和帕尼单抗。B-hEGFR小鼠为雄性，14–15周龄，每组n=6。动物每周接受一次静脉注射，连续给药五周后，进行一般毒理学、血液毒理学和病理学分析。
研究结果显示，45.0 mg/kg西妥昔单抗组和30.0 mg/kg帕尼单抗组均观察到明显体重下降。毒代动力学分析显示，西妥昔单抗生物类似药的暴露量随剂量比例增加，提示其在测量剂量范围内呈线性药代动力学特征。
组织病理学检查显示，西妥昔单抗和帕尼单抗均可诱导鼻部皮肤鳞状上皮增生及炎性细胞浸润，并引起胃限沟鳞状上皮细胞增生，且呈剂量相关趋势。两种药物未对腹部皮肤及小肠至直肠产生明显毒性。整体来看，该模型中观察到的皮肤和胃部毒性分布，与临床报道具有较好一致性[4,5]。
图4 B-hEGFR小鼠的一般毒性，TK和病理分析
（A）45.0mg/kg西妥昔单抗组和30.0mg/kg帕尼单抗连续五周给药后导致体重下降。（B）在首次和第4次给药后，分别于给药后 1 h、8 h、24 h、48 h、96 h 和 168 h 采集血样，并测定血液中的西妥昔单抗和帕尼单抗浓度，西妥昔单抗生物类似药的血药浓度与给药剂量之间呈线性关系。（C）组织病理学检查显示，在鼻部皮肤中，西妥昔单抗生物类似药45mg/kg剂量组出现了与受试物相关的改变（1/6，轻微），表现为鳞状上皮细胞增生和皮下炎性细胞浸润。帕尼单抗组也发现了类似的与受试物相关的改变（5/6，轻微）。在西妥昔单抗生物类似药12.5mg/kg组（4/6，轻微）和45mg/kg组（2/6，轻微；4/6，轻度）给药的小鼠中，观察到胃限沟鳞状上皮细胞增生，该改变被认为与受试物和剂量相关。帕尼单抗组也发现了类似的与受试物相关的改变（3/6，轻微；3/6，轻度）。
血常规检测中，45.0 mg/kg西妥昔单抗生物类似药和30.0 mg/kg帕尼单抗组观察到中性粒细胞（NEUT）和单核细胞（MONO）计数升高，其他血液学参数无明显变化。该结果与部分临床报道并不完全一致[7,8]。这种差异可能与临床血液学不良反应发生率较低、药物作用机制并不直接靶向骨髓造血细胞，以及物种间差异有关。因此，该血液学差异并不影响B-hEGFR小鼠作为EGFR靶向药物早期毒理学研究工具的预测价值。
图5 B-hEGFR小鼠的全血细胞计数检测
45.0 mg/kg西妥昔单抗生物类似药和30.0 mg/kg帕尼单抗导致中性粒细胞和单核细胞数量增加，而其他治疗组的血液学参数无明显变化。数值以均值±标准差（SD）表示。显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定。*p<0.05，**p<0.01。
第二个案例使用EGFR靶向西妥昔单抗-MMAE相似物，该分子由百奥赛图内部合成。MMAE（Monomethyl auristatin E）是一种微管蛋白抑制剂，可阻断快速分裂细胞的微管网络，导致细胞周期停滞和细胞死亡[3]。
研究使用雌性B-hEGFR小鼠，年龄为5–7周，每组n=2–3。动物每周接受一次静脉注射，连续五周进行A-E亚组试验。每次给药前观察皮肤和眼部毒性，并在各亚组研究结束后进行一般毒理学、血液毒理学和病理学评估。
结果显示，80 mg/kg西妥昔单抗-MMAE相似物在第三次给药前未引起明显体重下降。但在三次给药后，该组动物出现严重非正常死亡，发生率为7/8。同时，在第二次和第三次给药前，研究者已观察到明显的皮肤和眼部毒性，包括口鼻部、眼周、部分腹部和耳部的进行性脱毛，以及眼周肿胀、眼部分泌物增加和角膜混浊。
图6 B-hEGFR小鼠的一般毒性，皮肤和眼科检查
（A）80 mg/kg西妥昔单抗-MMAE相似物给在第三次给药前体重无明显下降（B）第三次给药后动物出现异常死亡，生存率直线下降。（C）皮肤毒性代表性图像：第二次给药前，在口鼻部、眼部周围以及部分腹部和耳部观察到进行性脱毛，第三次给药前严重程度加重。黄色箭头表示以脱毛为特征的皮肤毒性区域，红色箭头表示眼部异常。此外，还观察到眼周肿胀、大量眼分泌物和角膜混浊，汇总于下方表格。
病理学分析进一步支持上述观察。口鼻部和眼周皮肤区域可见明显表皮增生或增厚、皮下混合性炎性细胞浸润及轻微糜烂。部分口鼻部和腹部皮肤区域还观察到结痂形成和中度溃疡。
眼部病理学分析显示，异常主要局限于眼球，包括角膜基质中性粒细胞浸润、神经节细胞萎缩和内核层细胞萎缩，视神经未见病理改变。其他器官中，观察到轻微肝脏髓外造血、子宫萎缩，以及严重卵巢间质腺萎缩和卵泡消失。肺、肾、食道未见明显毒性。
这些结果提示，B-hEGFR小鼠中观察到的毒性，可能源于EGFR介导的靶内毒性与MMAE载荷相关细胞毒性的共同作用。相关表现与临床中EGFR单抗相关皮肤毒性、MMAE载荷相关眼部毒性，以及ADC潜在生殖毒性具有一定一致性[4,8,9]。
图7 B-hEGFR人源小鼠的病理分析
（A）皮肤病理分析： 在口鼻部和眼周皮肤区域均观察到明显的表皮增生/增厚、皮下混合性炎性细胞浸润，以及糜烂。其他皮肤区域（包括腹部皮肤、耳部皮肤和耳周皮肤）观察到的病变程度相对较轻，严重程度依次递减。此外，在口鼻部和腹部皮肤区域还零星观察到结痂形成和中度溃疡。（B）眼部病理分析： 观察到局限于眼球的轻度异常，包括角膜基质中性粒细胞浸润、神经节细胞萎缩和内核层细胞萎缩，而视神经未发现病理改变。（C）其他器官病变包括，肝脏髓外造血和子宫萎缩，以及严重的卵巢间质腺萎缩。具体病变汇总于下方对应的表格。
血液学检测显示，首次给药后，80 mg/kg西妥昔单抗-MMAE组出现中性粒细胞（NEUT）和网织红细胞（RET）计数升高。在后续重复给药期间，中性粒细胞计数持续升高，同时血细胞比容（HCT）、嗜酸性粒细胞（EO）计数和嗜酸性粒细胞百分比下降。其他血液学参数无明显变化。
图8 B-hEGFR小鼠的全血细胞计数检测
在首次给药后，80 mg/kg西妥昔单抗-MMAE组观察到中性粒细胞（NEUT）和网织红细胞（RET）计数升高（上图）。在后续重复给药期间，持续观察到中性粒细胞计数升高，以及血细胞比容（HCT）、嗜酸性粒细胞（EO）计数和嗜酸性粒细胞百分比下降（下图）。其他血液学参数无明显变化。数据以均值±标准误（SEM）表示。采用非配对t检验；*p<0.05，**p<0.001。
综上，B-hEGFR人源化小鼠能够在非GLP毒理学研究中有效捕获EGFR靶向药物相关安全性信号。案例一中，EGFR单抗诱导的皮肤和胃部毒性分布与临床观察基本一致。案例二中，西妥昔单抗-MMAE相似物诱导明显皮肤、眼部及生殖相关组织病变，提示该模型可用于识别EGFR靶内毒性和ADC载荷相关毒性的叠加风险。
尽管血液学检测结果与部分临床报告存在一定差异，但考虑到临床不良反应发生率、药物作用机制和物种差异，这并不削弱模型在早期毒理学研究中的应用价值。整体来看，B-hEGFR模型可为EGFR ADC候选分子的安全性特征评估、剂量设计和GLP毒理研究前风险判断提供重要参考。
百奥赛图EGFR相关靶点人源化小鼠
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