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血脑屏障能够维持中枢神经系统内环境稳定，但同时也限制了抗体、核酸药物等大分子进入脑组织。如何在保证药物活性和安全性的前提下，提高候选分子的脑部暴露，是中枢神经系统药物开发面临的重要问题。对于肌营养不良、强直性肌营养不良等疾病，如何将药物有效递送至骨骼肌，同样是影响核酸药物疗效的关键环节。
转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1，TFR1）是一种参与铁摄取和铁代谢的跨膜蛋白，广泛表达于多种细胞和组织。由于TFR1在脑血管内皮细胞中具有较高表达，可通过受体介导的跨胞转运，将与其结合的药物分子由血液侧转运至脑组织，因此被广泛用于血脑屏障穿梭分子的开发[1]。除中枢神经系统递送外，TFR1在骨骼肌等组织中的表达也为抗体偶联寡核苷酸药物（antibody–oligonucleotide conjugate，AOC）的肌肉靶向递送提供了基础。
然而，靶向人TFR1的抗体通常具有明显的物种特异性，难以直接在普通小鼠中完成药代动力学、组织分布、药效及安全性评价。为此，百奥赛图开发了TFR1人源化小鼠，为TFR1穿梭分子及相关药物的体内研究提供了更具临床相关性的动物模型。
通过流式细胞术分析野生型C57BL/6（+/+）小鼠和纯合B-hTFR1（H/H）小鼠的脑细胞。采用抗小鼠TFR1 抗体和抗人TFR1抗体进行检测。结果显示，在野生型小鼠中，mTFR1仅可在脑内皮细胞中检测到；而hTFR1仅在纯合B-hTFR1小鼠中检测到，在野生型小鼠中未检测到。
TFR1对正常铁代谢及生理功能至关重要，Tfr1缺失可导致严重甚至致死性表型，而B-hTFR1小鼠表现出良好的健康状态[2]。
血常规分析显示，8周龄雌雄B-hTFR1小鼠的红细胞计数、血红蛋白、红细胞压积及网织红细胞等关键指标维持稳定，未观察到贫血表型。数据以平均值±SD表示。
血清铁稳态分析
B-hTFR1小鼠的血清铁浓度、总铁结合力（TIBC）及转铁蛋白饱和度整体稳定；4月龄和6月龄雌雄小鼠的血清铁浓度亦未见明显异常变化，提示TFR1人源化后血清铁稳态总体保持稳定。
观察抗TFR1抗体在脑实质中的分布
小鼠经尾静脉注射AF647标记的抗TFR1抗体。24小时后，采集脑组织并进行透明化处理，用于成像分析。采用IVIS成像系统对标记抗体在脑组织内的分布情况进行可视化检测。左侧和中间图分别展示了从两个不同角度观察的全脑图像，显示AF647荧光信号在脑内的广泛分布。右侧图为选定区域的放大图，展示了AF647标记抗体富集的详细血管网络结构，以及抗体在脑实质中的分布情况。
评价抗人TFR1抗体的血脑屏障穿透能力
TFR1 可促进抗体穿透血脑屏障（BBB）。将B-hTFR1小鼠经尾静脉分别注射同型对照抗体（human IgG1）、JR-141类似物以及自主研发的RenNano全人纳米抗体发现平台来源的抗TFR1仅重链抗体（HCAbs）。给药后0.5、6、24 或 72小时采集血清样本。实验终点，对麻醉小鼠经左心室灌注生理盐水以去除脑内血液，随后取脑组织进行匀浆，并通过加入右旋糖酐（dextran）和离心进行亚组分分离，以检测脑组织中的人 IgG（hIgG）浓度。
结果显示，与同型对照抗体相比，抗人TFR1抗体在脑组织中的暴露水平更高，证明TFR1能够促进抗体穿透血脑屏障（BBB）。
双人源化模型：TFR1与CD98HC脑部PK比较
抗人TFR1抗体与抗CD98HC抗体的体内药代动力学（PK）评价及比较。将B-hTFR1/hCD98HC小鼠（n=2，雌性，8周龄）经尾静脉注射对照IgG（10mpk）、抗人TFR1抗体（JR-141类似物，单价形式，内部制备，12.56mpk）以及抗人CD98HC抗体（CD98BBBB-h1.L类似物，单价形式，内部制备，13.3mpk）。随后采集脑组织进行体内PK评价。检测脑组织中的抗体浓度（A）以及每克脑组织中注射剂量的百分比（B）。
如图所示，在给药后24小时，抗人TFR1抗体表现出更高的脑组织暴露水平；而在给药后72小时，抗人CD98HC抗体表现出更高的脑组织暴露水平。
研究结果显示，两类抗体静脉给药后均可在脑组织中检测到。B-hTFR1/hCD98HC小鼠可用于比较靶向TFR1或CD98HC的穿梭分子在脑组织中的暴露水平及动力学差异。图中数据以平均值±SEM表示。
Trontinemab类似物在Tg(5×FAD)/B-hTFR1小鼠中的药效评价
与G2对照组相比，Trontinemab类似物治疗后，皮层可溶性Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值显著降低，而可溶性Aβ40水平无显著变化；脑脊液中Aβ42/Aβ40比值显著升高。组织病理学结果显示，治疗后皮层和海马区域Aβ阳性染色明显减少，表明Trontinemab类似物可有效降低脑内Aβ沉积。G1：C57BL/6，对照组；G2：Tg(5×FAD)/B-hTFR1，对照组；G3：Tg(5×FAD)/B-hTFR1，Trontinemab类似物。*P<0.05，***P<0.001；ns，无统计学差异。
注：本实验由百奥赛图与客户合作完成，实验采用Tg(5×FAD)/B-hTFR1小鼠。
AOC药物的骨骼肌递送及DMPK基因沉默验证
抗体-寡核苷酸偶联药物（AOC）对杂合型B-hTFR1/hDMPK小鼠中人DMPK基因的抑制效果。将抗体-寡核苷酸偶联药物（3mpk，内部制备）、裸抗体（3mpk，内部制备）以及PBS分别于第0天通过给药处理杂合型B-hTFR1/hDMPK小鼠。第7天处死小鼠，收集肝脏、腓肠肌和胫骨前肌组织，通过qPCR检测人源DMPK mRNA的表达水平。
结果显示，与对照组（裸抗体组和PBS组）相比，抗体-寡核苷酸偶联药物处理组中胫骨前肌的人DMPK mRNA水平显著降低，证明B-hTFR1/hDMPK小鼠可作为一种有效的临床前模型，用于体内评价靶向人DMPK的抗体-寡核苷酸偶联药物。数据以平均值±SEM表示。
随着TFR1递送药物进入临床前开发后期，除递送效率和药效外，其安全性同样需要系统评估。为支持TFR1靶向药物的安全性评价，百奥赛图对B-hTFR1小鼠进行了系统的基础表型分析，建立了覆盖血常规、血液生化、主要组织器官病理及体重变化等多维度的参考数据。这些基础数据为后续候选药物的重复给药、靶向相关毒性及剂量—毒性关系评价提供了重要的背景参考。
多维生理指标参考数据
B-hTFR1小鼠2至16月龄主要血液学指标总体稳定，未观察到贫血表型。
B-hTFR1小鼠2至16月龄主要血液生化指标总体稳定，未见明显异常趋势。
纯合子B-hTFR1小鼠主要器官的组织病理学分析。取B-hTFR1小鼠（雌性，6月龄，n=3）的组织，经4%多聚甲醛固定后进行苏木精-伊红（H&E）染色。图中展示代表性显微照片。放大倍数：40×。
B-hTFR1小鼠与C57BL/6小鼠的体重增长比较。（A）雄性和雌性B-hTFR1小鼠3至24周龄期间的纵向体重变化。（B）2、6、10和16月龄雌性及雄性B-hTFR1小鼠的体重，并与年龄和性别匹配的野生型C57BL/6小鼠（黑色柱）进行比较。数据以均值±SEM表示。
[1] Huang Q, Chan KY, Wu J, et al. An AAV capsid reprogrammed to bind human transferrin receptor mediates brain-wide gene delivery. Science. 2024;384(6701):1220-1227. doi:10.1126/science.adm8386
[2] Xu W, Barrientos T, Mao L, Rockman HA, Sauve AA, Andrews NC. Lethal Cardiomyopathy in Mice Lacking Transferrin Receptor in the Heart. Cell Rep. 2015;13(3):533-545. doi:10.1016/j.celrep.2015.09.023
