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    从hu-PBMC到hu-CD34⁺ HSC：不同药物形式如何匹配免疫重建模型

    从hu-PBMC到hu-CD34⁺ HSC：不同药物形式如何匹配免疫重建模型

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    免疫治疗药物的研发重点，已经从单一靶点抑制转向对免疫网络的系统性调控。肿瘤领域，检查点抑制剂成为标准疗法的组成部分；自身免疫与过敏性疾病中，靶向单克隆抗体实现了从症状控制到炎症通路阻断的跨越；感染性疾病中，治疗性疫苗、广谱中和抗体及免疫调节剂也在持续推进。与此同时，双特异性抗体、T细胞衔接器、CAR-T/TCR-T细胞治疗、NK细胞疗法以及工程化细胞因子等多种新型免疫治疗手段相继进入临床前与临床开发阶段[1]。

    图1：免疫治疗策略分类示意图[1]

    包括疫苗、单克隆抗体、融合蛋白、细菌、肿瘤溶解病毒、细胞因子以及不同类型的细胞免疫治疗

    免疫治疗药物在研发过程中面临的共性难题并非分子设计本身，而是如何在体内环境中可靠地评估其有效性与安全性。检查点抑制剂的疗效依赖于T细胞再激活与抗原呈递；双特异性抗体依赖人源T细胞对肿瘤抗原的定向识别；CAR-T细胞则涉及肿瘤浸润、持久性维持、耗竭及细胞因子释放综合征（CRS）等多重因素。传统的同系小鼠模型或普通异种移植模型（CDX）无法充分还原人源T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞与髓系细胞之间的复杂交互，物种差异可能导致药效信号的误判或遗漏[2]。

    免疫重建小鼠模型的建立，正是为了弥补上述缺口。其基础宿主多为重度免疫缺陷小鼠，如NSG、百奥赛图自主研发的B-NDG等，这些小鼠缺失功能性T、B、NK细胞，能够支持人源免疫细胞的长期植入与分化。目前主流的构建方式可分为三类：

    hu-PBMC 模型

    将人外周血单个核细胞（PBMC）经尾静脉或腹腔注射入免疫缺陷小鼠体内。2周后即可建立起以人源T细胞为主的免疫应答，适用于双特异性抗体、T细胞衔接器以及体内CAR-T效果的早期快速筛选。但其局限性在于重建的免疫谱系较为单一，且易诱发移植物抗宿主病（GVHD），实验窗口一般仅为4–6周。

    hu-CD34⁺ HSC模型

    在亚致死辐照或清髓处理后，将人脐带血或骨髓来源的CD34⁺造血干细胞植入宿主。人源干/祖细胞在小鼠骨髓及胸腺微环境中逐步分化为T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞及髓系细胞，形成多谱系免疫系统。重建周期约为8-12周，GVHD风险较低，实验窗口较长，更适用于检查点抑制剂、联合用药方案以及长期疗效与生物标志物的研究。

    BLT 模型

    移植胎儿胸腺和胎肝到经过辐照的重度免疫缺陷小鼠肾包膜下，同时接种人的骨髓造血干细胞进行免疫重建，构建携带完整人类造血与免疫系统的小鼠模型，此模型更接近真实的人源免疫微环境，但是依赖胎儿组织、来源受限且存在伦理约束[3-5]。

    图2. 三种方式免疫重建小鼠[6]

    对于药物研发者而言，合理运用不同类型的免疫重建模型有助于提升临床前评估的可靠性，为免疫治疗药物的早期决策提供了更具人体相关性的实验依据。百奥赛图自主研发多种hu-PBMC、hu-CD34⁺HSC免疫重建小鼠，可根据药物类型和作用机制灵活匹配模型方案，在单抗、双抗、ADC、药物联合治疗等不同治疗手段的药效评价中均有应用实例。

     

    hu-PBMC小鼠模型部分数据展示

    • 人PBMC重建的B-NDG小鼠中PD-L1抗体的抗肿瘤活性

    在RKO肿瘤模型中，使用PD-L1抗体对不同人PBMC植入时间点的B-NDG小鼠进行治疗。RKO细胞（5E6），皮下注射；人PBMC细胞（5E6），静脉注射；B-NDG小鼠（雌性，6周龄，n=6）；实验药物：Atezolizumab（10 mg/kg，皮下注射，共6次）。结果显示：PBMC植入的时间点会产生不同的抗肿瘤活性。 数值以Mean± SEM表示。
     

    • 人PBMC重建的B-NDG小鼠中PD-1/VEGFA双抗的抗肿瘤活性

    抗人PD-1/VEGFA双特异性抗体Ivonescimab（亦称AK112）在基于人PBMC重建的人源化异种移植模型中的抗肿瘤活性。将HCC827（人非小细胞肺癌）细胞皮下注射B-NDG小鼠（雌性，9周龄，n=6）体内，待肿瘤体积达到约250-300 mm3时进行分组，并在此时间点注射人PBMC（5×106），然后使用抗体进行治疗。如图所示，AK112在人PBMC重建的B-NDG小鼠中能有效控制肿瘤生长。数值以Mean± SEM表示。通过t检验确定显著性。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。 

    •  人PBMC重建的B-NDG小鼠中BiTE的体内药效评价

    双特异性T细胞受体（BiTE）——CD3×Her2在人PBMC重建的B-NDG小鼠中的体内药效评估。NCI-N87细胞（1×107），皮下注射；人PBMC（5×106），静脉注射。B-NDG小鼠（雌性，6周龄，n=6）。结果显示：CD3×Her2双特异性抗体表现出显著的肿瘤抑制作用。数值以Mean± SEM表示。
    B-luc-GFP Raji细胞（5×105），静脉注射；人PBMC（1×106），静脉注射。B-NDG小鼠（雌性，5周龄，n=5）。结果显示：CD3×CD20双特异性抗体表现出显著的肿瘤抑制作用。数值以Mean± SEM表示。
    SHP-77细胞（5×106），皮下注射；人PBMC，静脉注射。B-NDG小鼠（雌性，6周龄，n=6）。结果显示：CD3×DLL3双特异性抗体表现出显著的肿瘤抑制作用。 数值以Mean± SEM表示。
     

    • ADC+PD-1联用在人PBMC免疫重建小鼠模型中的研究设计

    淋巴细胞的变化

    •  人PBMC重建的B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠可延长实验窗口期

    人PBMC成功在B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠中重建。在第0天，B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠（n=6）通过静脉注射植入人PBMC（1×107）。每周采集外周血以分析人免疫细胞的重建水平。实验在植入后112天（16周）结束。A.重建的人免疫细胞频率；B.重建的人免疫细胞绝对细胞数。结果显示:在B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠中重建人PBMC两周后，外周血中CD45+细胞的频率和绝对细胞数开始增加，并保持相对稳定的重建水平直至16周的终点。重建的人T细胞频率从两周开始超过90%，并持续上升，最终接近100%。重建的人T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞（Tregs）。同时，也可检测到少量树突状细胞（DCs）。人PD-1在CD4+T细胞和CD8+T细胞上广泛表达。这表明B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠是人PBMC重建的优质免疫缺陷小鼠模型。数值以Mean± SEM表示。

    B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠人PBMC重建后，寿命更长且移植物抗宿主病（GvHD）的严重程度降低。在第0天，通过静脉注射将人PBMC（1×107）移植到B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠体内（n=6）。采用Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠的存活率。每周测量两次体重。每周对GvHD的临床症状进行一次评分。当体重下降超过20%时，实施安乐死。同时，将小鼠的GvHD评分记录为10。结果显示:所有小鼠均能存活至96天。在此期间，除体重减轻外，未出现其他明显的GvHD症状。数值以Mean± SEM表示。

    比较B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus小鼠和B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠重建人PBMC后诱导的GvHD严重程度。B-NDG小鼠、B-NDG B2m KO plus和B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠（雌性，7周龄，n=6）；预处理：1.0 Gy照射；人PBMC（5×106），静脉注射。结果显示：与B-NDG小鼠或B-NDG B2m KO plus小鼠相比，B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠在接受人PBMC重建后，其寿命可显著延长，且GvHD的发生率降低。数值以Mean± SEM表示。 

    • 人PBMC重建的B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠中in vivo CAR-T的药效评价

     
    B-NDG MHC I/II DKO plus小鼠，6-8周龄；人PBMC重建。
     
     
    数值以Mean± SEM表示，并采用单因素方差分析结合Dunnett法与G2进行比较。 *p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001
     

    数值以Mean± SEM表示，并采用单因素方差分析结合Dunnett法与G1进行比较。**p<0.01

     

    hu-CD34⁺HSC小鼠模型部分数据展示

    • CD34⁺HSC重建的B-NDG小鼠中的药效评价

    HSC重建的B-NDG小鼠（雌性，14周龄）；MDA-MB-231细胞（1E7），皮下注射；试验药物：Keytruda（3 mg/kg，腹腔注射，共6次。数值以Mean± SEM表示。

     

    HSC重建的B-NDG hIL15小鼠（雌性，19周龄）；RKO细胞（5E6），皮下注射；试验药物：Atezolizumab（5 mg/kg，腹腔注射，共6次）。数值以Mean± SEM表示。

    • CD34⁺HSC重建的B-NDG hIL15 plus小鼠模型中双抗的抗肿瘤药效评价

     
    CD3×HER2双特异性抗体在huHSC-B-NDG hIL15小鼠中的抗肿瘤活性。将胰腺癌细胞皮下植入到huHSC-B-NDG hIL15小鼠（雌性，10周龄，n=5）体内。当肿瘤体积达到约100-150 mm3时，对小鼠进行分组，并在此时间点对各组小鼠进行图中所示抗体的腹腔注射。数值以Mean± SEM表示。
     
     
    CD3×CD20双特异性抗体在huHSC-B-NDG hIL15小鼠中的抗肿瘤活性。将Raji细胞皮下植入到huHSC-B-NDG hIL15小鼠（雌性，12周龄，n=6）体内。当肿瘤体积达到约80-100 mm3时，对小鼠进行分组，并在此时间点对各组小鼠进行图中所指示抗体的腹腔注射。数值以Mean± SEM表示。

    • CD34⁺HSC重建的B-NDG hIL15 plus小鼠模型中联合疗法的药效评价

     
    ADC-HER2+Keytruda联合疗法在huHSC-B-NDG hIL5小鼠中的体内疗效评估。huHSC-B-NDG hIL15小鼠（雌性，16周龄）；胃癌：NCI-N87（1E7），皮下注射； 试验药物：RC48+Keytruda。 数值以Mean± SEM表示。

    • CD34⁺HSC重建的B-NDG hIL15小鼠模型中LNP CD19-In Vivo CAR的药效评价

     
    注射后3小时的CAR表达水平。通过流式细胞术分析，在总人白细胞中hCD45⁺细胞的比例（hCD45⁺细胞 + hCD45⁻细胞），hCD45⁺细胞中的T细胞比例，T细胞中的hCD4⁺和hCD4⁻细胞比例，hCD4⁺ T细胞中的CAR⁺细胞比例，以及CD3⁺hCD4⁺ T细胞中的CAR⁺细胞比例。数值以Mean± SEM表示，并采用单因素方差分析结合Dunnett法与G1（对照组）进行比较。*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001

    • LNP CD19-In Vivo CAR对CD34⁺HSC重建的B-NDG hIL15小鼠模型的B细胞消耗

     
    体内CAR注射后B细胞消耗情况。（A）鼠和人CD45⁺细胞以及T&B细胞的细胞计数；（B）hCD45⁺细胞占总白细胞的比例，以及hCD45⁺细胞中T&B细胞的比例。数值以Mean± SEM表示。
     

    参考文献：

    [1] Varadé J, et al. Human immunology and immunotherapy: main achievements and challenges. Cellular & Molecular Immunology, 2020.

    [2] Gulati P, et al. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. Cancer Immunol Res, 2021. PMC7783739.

    [3] Shultz LD, Brehm MA, Garcia-Martinez JV, Greiner DL. Humanized mice for the study of immuno-oncology. Trends Immunol. 2018:39(9):748-763.

    [4] Li Z, Yang X, Song X. Humanized mouse models for cancer immunotherapy: a focus on human PBMC and HSPC reconstitution. In: Tan SL, ed. Animal Models for the Development of Cancer Immunotherapy. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, Inc.; 2022:201–230. Chapter 7.

    [5] Lyu Y, Yang YG, Hu Z. Recent advances in the construction of humanized animal models and applications in translational medicine. Animal Models and Experimental Medicine, 2026.

    [6]De La Rochere P, etc. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 2018 Sep;39(9):748-763.